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③加抗另一抗原决定簇的酶标记抗体，37℃保温反应。抗原抗体反应的最适温度为37℃

南志标团队经过多年努力，筛选获得了高内生真菌带菌率、抗锈病的坪用多年生黑麦草兰黑1号，是国内第一个禾草-内生真菌共生体新品系，2020年已获批进入国家林业和草原局新品种区域试验。相关链接：真菌，植物，乳酸杆菌，生物碱。切小口、塞入真菌经过三周左右的培养，2019年3月，带菌的幼苗被栽种至海拔1620米的兰州大学景泰草地农业试验站。这就好比大麦本来长得好好的，我们通过人工接种给它上了一道保险。李春杰和博士生王正凤选择柴青1号裸大麦和扬饲麦1号皮大麦两个品种，经过酒精、次氯酸钠严格消毒，拿起手术刀对着保温箱里精心培育出的大麦幼苗，动起了手术。

李春杰在甘肃河西走廊的盐碱地上发现野大麦自带内生真菌，但栽培大麦并不具备这一特点。但在利用内生真菌进行粮饲作物育种领域，国内外几乎都是空白。（3）本研究建立完善的参柏洗剂质量标准方法简单、重复性好，准确可靠，为参柏洗剂的质量标准修订提供依据，可用作该药的质量控制标准。

结果显示：样品离心后再提取，可以减少乳化现象，且样品含量测定数据平行性较好。样品加浓氨试液摇匀，静置与否，苦参碱和氧化苦参碱含量测定结果基本一致，为节约时间，确定为样品加浓氨试液摇匀后，无需静置，可直接进行提取。3.4.7加样回收率试验取同一批次参柏洗剂（批号：20200501）9份，每份5 mL，分别加入一定量的苦参碱和氧化苦参碱对照品，按照3.3项下方法制备供试品溶液，再按3.1.5项下色谱条件测定，计算苦参碱、氧化苦参碱回收率，结果苦参碱平均回收率为99.27%，RSD为2.11%，氧化苦参碱平均回收率为103.07%，RSD为1.68%，表明所建立方法回收率良好，结果见表1、2。3.4.8参柏洗剂样品含量测定精密量取参柏洗剂离心后的上清液10 mL，置分液漏斗中，加入浓氨试液0.5 mL，摇匀，加三氯甲烷振摇提取4次，20 mL/次，合并三氯甲烷液，回收溶剂至干，残渣加无水乙醇使溶解，转移至5 mL量瓶中，并加无水乙醇至刻度，摇匀，即得。

3.4.6中间精密度试验由本实验室其他实验人员在不同时间和不同液相色谱仪上操作，对同一批参柏洗剂（批号：20200501），按3.3项下方法分别制备6份供试液，按照3.1.5项下色谱条件测定含量，结果苦参碱和氧化苦参碱总和RSD为1.86%（n=12），表明所建含量测定方法中间精密度良好。测定方法分别精密吸取苦参碱和氧化苦参碱对照品溶液10 L与供试品溶液5 L，进样，测定，结果见表3。

提取过程中考察了样品是否离心再提取、加浓氨试液后是否静置一段时间再提取、以及三氯甲烷提取次数。并通过试验摸索，使用苦参、黄柏鉴别项下供试品溶液，也可鉴别出臣药-地骨皮，增加了臣药薄层色谱鉴别方法②精密称取氧化苦参碱（110780-201007，以92.3%计）12.06 mg，置25 mL量瓶中，加乙腈∶无乙醇（80∶20）的混合溶液溶解，并稀释定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含0.4452 mg的对照品储备液。3.1.5色谱条件的确定以氨基键合硅胶为填充剂[ Agilent Zorbax NH2柱 (规格：4.6 mm250 mm，粒径：5 m)]，配制乙腈-乙醇-3%磷酸水溶液体积比为（84∶7∶9）的溶液作为流动相，流速为每分钟1.0 mL。

3.3供试液的制备分别考察了样品是否离心、加浓氨试液摇匀后是否静置、以及三氯甲烷提取次数（3次、4次、5次）对苦参碱和氧化苦参碱提取效果的影响，综合考虑苦参碱和氧化苦参碱含量及提取操作过程中乳化现象情况，最终确定供试液的制备方法如下：精密量取参柏洗剂离心（3000 r/min，5min）后的上清液10 mL，置分液漏斗中，加入浓氨试液0.5 mL，摇匀，加三氯甲烷振摇提取4次，20 mL/次，合并三氯甲烷液，回收溶剂至干，残渣加无水乙醇使溶解，转移至5 mL量瓶中，并加无水乙醇至刻度，摇匀，即得。3.4.3精密度考察精密吸取参柏洗剂（批号：20200501）供试品溶液5 L，连续进样6次，按照3.1.5项下色谱条件测定。②分别精密吸取氧化苦参碱对照品储备液（0.4452 mg/mL）0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，放置5 mL量瓶中，加乙腈∶无水乙醇（80∶20）稀释至刻度，制得浓度分别为0.04452 mg/mL、0.08904 mg/mL、0.17808 mg/mL、0.26712 mg/mL、0.35616 mg/mL、0.4452 mg/mL的氧化苦参碱对照品溶液，分别进样5 L，按3.1.5项下色谱条件测定，以峰面积的积分值Y为纵坐标，以进样氧化苦参碱量X为横坐标，进行线性回归，得回归方程Y=435.908542X-20.675117（r=0.99993），表明氧化苦参碱进样量在0.2226 g～2.226 g范围内与峰面积线性关系良好。结果苦参阴性液相色谱图在与对照品和供试品液相色谱图相同保留时间位置上无色谱峰出现，说明该含量测定方法专属性较好，见图4。

声明：本文所用图片、文字来源《辽宁中医药大学学报》，版权归原作者所有。3.1.3柱温的考察分别考察了柱温设置为30 ℃、35 ℃、40 ℃时，苦参碱和氧化苦参碱色谱峰的分离情况，结果三个不同柱温条件下均可达到分离，综合考虑分离度、分析时间、峰形等因素，本实验确定柱温为40 ℃。

3.4.4稳定性考察取参柏洗剂（批号：20200501）供试品溶液，分别在0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、21 h、24 h小时进样5 L，按照3.1.5项下色谱条件测定。3.4.2线性考察①分别精密吸取苦参碱对照品储备液（1.09 mg/mL）0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL，放置2 mL量瓶中，加乙腈∶无水乙醇（80∶20）稀释至刻度，制得浓度分别为0.109 mg/mL、0.218 mg/mL、0.436 mg/mL、0.654 mg/mL、0.872 mg/mL、1.09 mg/mL的苦参碱对照品溶液，分别进样5 L，按3.1.5项下色谱条件测定，以峰面积的积分值Y为纵坐标，以进样苦参碱量X为横坐标进行线性回归，得回归方程Y=435.908542X-20.675117（r=0.99988），表明苦参碱进样量在0.545 g～5.45 g范围内与峰面积线性关系良好。

相关链接：色谱，乙腈，乙醇。分别精密吸取苦参碱和氧化苦参碱对照品溶液、参柏洗剂供试品溶液、苦参阴性对照溶液各5 L，按3.1.5项下色谱条件测定。3.4分析方法验证3.4.1专属性考察取苦参阴性对照样品，照供试液制备的方法制得阴性对照溶液。3.1.4色谱柱的考察分别考察了菲罗门Luna NH2柱、Waters Xbridge BEH Amide色谱柱、Agilent Zorbax NH2柱(规格：4.6 mm250 mm，粒径：5 m)]色谱峰分离效果，结果前两根色谱柱存在分离度或峰形差的现象，本实验最终采用了Agilent Zorbax NH2柱。计算苦参碱色谱峰面积RSD值为0.18%（n=6），氧化苦参碱色谱峰面积RSD值为0.99% (n=6)，表明所用仪器设备精密度较好。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系删除。

3.4.5重复性试验按拟定的含量测定方法，对同一批参柏洗剂(批号：20200501)分别制备6份供试液，按照3.1.5项下色谱条件测定含量，结果苦参碱平均含量为0.2330 mg/mL，RSD为1.92%（n=6），氧化苦参碱平均含量为0.0448 mg/mL，RSD为1.43%（n=6），苦参碱和氧化苦参碱总和平均含量为0.2778 mg/mL，RSD为1.82%（n=6），表明所建含量测定方法的重复性良好。计算苦参碱色谱峰面积RSD值为0.50% （n=8），氧化苦参碱色谱峰面积RSD为1.08%（n=8），表明该含量测定供试品溶液在24h内稳定性良好。

3.2苦参碱和氧化苦参碱对照品溶液的配制①精密称取苦参碱（110805-200306）10.90 mg，置10 mL量瓶中，加乙腈∶无乙醇（80∶20）的混合溶液溶解，并稀释定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含1.09 mg的对照品储备液。3苦参中苦参碱和氧化苦参碱含量测定3.1色谱条件3.1.1流动相的考察曾参考《中国药典》2015年版一部第202页苦参项下收载的苦参碱和氧化苦参碱含量测定色谱条件，以乙腈-乙醇-3%磷酸水溶液（80∶10∶10）为流动相，流速为每分钟1 mL，柱温设置为35 ℃，检测波长=220 nm，结果供试品色谱中苦参碱和氧化苦参碱色谱峰分离度差或是存在峰形不好的现象，经摸索，对流动相比例进行调整，调整为以乙腈-乙醇-3%磷酸水溶液（84∶7∶9）为流动相，柱温设置为40 ℃，其他色谱条件不变，供试品中苦参碱和氧化苦参碱色谱峰能达到基线分离，且阴性对照无干扰，3.1.2流动相流速的考察分别考察了流动相流速为每分钟0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL苦参碱和氧化苦参碱色谱峰的分离效果，结果在三种不同流速情况下均可达到基线分离，综合考虑分析时间、分离度、色谱峰峰形、仪器分析压力等因素，本实验确定流速为每分钟1 mL

3.4分析方法验证3.4.1专属性考察取苦参阴性对照样品，照供试液制备的方法制得阴性对照溶液。3.3供试液的制备分别考察了样品是否离心、加浓氨试液摇匀后是否静置、以及三氯甲烷提取次数（3次、4次、5次）对苦参碱和氧化苦参碱提取效果的影响，综合考虑苦参碱和氧化苦参碱含量及提取操作过程中乳化现象情况，最终确定供试液的制备方法如下：精密量取参柏洗剂离心（3000 r/min，5min）后的上清液10 mL，置分液漏斗中，加入浓氨试液0.5 mL，摇匀，加三氯甲烷振摇提取4次，20 mL/次，合并三氯甲烷液，回收溶剂至干，残渣加无水乙醇使溶解，转移至5 mL量瓶中，并加无水乙醇至刻度，摇匀，即得。

3.1.3柱温的考察分别考察了柱温设置为30 ℃、35 ℃、40 ℃时，苦参碱和氧化苦参碱色谱峰的分离情况，结果三个不同柱温条件下均可达到分离，综合考虑分离度、分析时间、峰形等因素，本实验确定柱温为40 ℃。②分别精密吸取氧化苦参碱对照品储备液（0.4452 mg/mL）0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，放置5 mL量瓶中，加乙腈∶无水乙醇（80∶20）稀释至刻度，制得浓度分别为0.04452 mg/mL、0.08904 mg/mL、0.17808 mg/mL、0.26712 mg/mL、0.35616 mg/mL、0.4452 mg/mL的氧化苦参碱对照品溶液，分别进样5 L，按3.1.5项下色谱条件测定，以峰面积的积分值Y为纵坐标，以进样氧化苦参碱量X为横坐标，进行线性回归，得回归方程Y=435.908542X-20.675117（r=0.99993），表明氧化苦参碱进样量在0.2226 g～2.226 g范围内与峰面积线性关系良好。3苦参中苦参碱和氧化苦参碱含量测定3.1色谱条件3.1.1流动相的考察曾参考《中国药典》2015年版一部第202页苦参项下收载的苦参碱和氧化苦参碱含量测定色谱条件，以乙腈-乙醇-3%磷酸水溶液（80∶10∶10）为流动相，流速为每分钟1 mL，柱温设置为35 ℃，检测波长=220 nm，结果供试品色谱中苦参碱和氧化苦参碱色谱峰分离度差或是存在峰形不好的现象，经摸索，对流动相比例进行调整，调整为以乙腈-乙醇-3%磷酸水溶液（84∶7∶9）为流动相，柱温设置为40 ℃，其他色谱条件不变，供试品中苦参碱和氧化苦参碱色谱峰能达到基线分离，且阴性对照无干扰，3.1.2流动相流速的考察分别考察了流动相流速为每分钟0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL苦参碱和氧化苦参碱色谱峰的分离效果，结果在三种不同流速情况下均可达到基线分离，综合考虑分析时间、分离度、色谱峰峰形、仪器分析压力等因素，本实验确定流速为每分钟1 mL。3.1.4色谱柱的考察分别考察了菲罗门Luna NH2柱、Waters Xbridge BEH Amide色谱柱、Agilent Zorbax NH2柱(规格：4.6 mm250 mm，粒径：5 m)]色谱峰分离效果，结果前两根色谱柱存在分离度或峰形差的现象，本实验最终采用了Agilent Zorbax NH2柱。

3.1.5色谱条件的确定以氨基键合硅胶为填充剂[ Agilent Zorbax NH2柱 (规格：4.6 mm250 mm，粒径：5 m)]，配制乙腈-乙醇-3%磷酸水溶液体积比为（84∶7∶9）的溶液作为流动相，流速为每分钟1.0 mL。3.4.3精密度考察精密吸取参柏洗剂（批号：20200501）供试品溶液5 L，连续进样6次，按照3.1.5项下色谱条件测定。

计算苦参碱色谱峰面积RSD值为0.50% （n=8），氧化苦参碱色谱峰面积RSD为1.08%（n=8），表明该含量测定供试品溶液在24h内稳定性良好。3.2苦参碱和氧化苦参碱对照品溶液的配制①精密称取苦参碱（110805-200306）10.90 mg，置10 mL量瓶中，加乙腈∶无乙醇（80∶20）的混合溶液溶解，并稀释定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含1.09 mg的对照品储备液。

如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系删除。3.4.4稳定性考察取参柏洗剂（批号：20200501）供试品溶液，分别在0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、21 h、24 h小时进样5 L，按照3.1.5项下色谱条件测定。

相关链接：色谱，乙腈，乙醇。3.4.5重复性试验按拟定的含量测定方法，对同一批参柏洗剂(批号：20200501)分别制备6份供试液，按照3.1.5项下色谱条件测定含量，结果苦参碱平均含量为0.2330 mg/mL，RSD为1.92%（n=6），氧化苦参碱平均含量为0.0448 mg/mL，RSD为1.43%（n=6），苦参碱和氧化苦参碱总和平均含量为0.2778 mg/mL，RSD为1.82%（n=6），表明所建含量测定方法的重复性良好。声明：本文所用图片、文字来源《辽宁中医药大学学报》，版权归原作者所有。分别精密吸取苦参碱和氧化苦参碱对照品溶液、参柏洗剂供试品溶液、苦参阴性对照溶液各5 L，按3.1.5项下色谱条件测定。

结果苦参阴性液相色谱图在与对照品和供试品液相色谱图相同保留时间位置上无色谱峰出现，说明该含量测定方法专属性较好，见图4。3.4.2线性考察①分别精密吸取苦参碱对照品储备液（1.09 mg/mL）0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL，放置2 mL量瓶中，加乙腈∶无水乙醇（80∶20）稀释至刻度，制得浓度分别为0.109 mg/mL、0.218 mg/mL、0.436 mg/mL、0.654 mg/mL、0.872 mg/mL、1.09 mg/mL的苦参碱对照品溶液，分别进样5 L，按3.1.5项下色谱条件测定，以峰面积的积分值Y为纵坐标，以进样苦参碱量X为横坐标进行线性回归，得回归方程Y=435.908542X-20.675117（r=0.99988），表明苦参碱进样量在0.545 g～5.45 g范围内与峰面积线性关系良好。

②精密称取氧化苦参碱（110780-201007，以92.3%计）12.06 mg，置25 mL量瓶中，加乙腈∶无乙醇（80∶20）的混合溶液溶解，并稀释定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含0.4452 mg的对照品储备液。计算苦参碱色谱峰面积RSD值为0.18%（n=6），氧化苦参碱色谱峰面积RSD值为0.99% (n=6)，表明所用仪器设备精密度较好

结果显示，参柏洗剂供试品色谱图中，在与黄柏对照药材和盐酸小檗碱对照品色谱图对应Rf值处，显相同的亮黄色荧光斑点，且黄柏阴性无干扰，见图2。按照参柏洗剂处方比例和工艺，制得地骨皮阴性样品，再按供试品溶液制备方法操作，制得地骨皮阴性对照溶液。